Введение

Формирование бронхолёгочной дисплазии (БЛД) в исходе респираторного дистресс-синдрома (РДС) у недоношенных детей, даже при условии адекватной антенатальной и постнатальной профилактики, современной и правильной респираторной поддержки, а также адекватного нутритивного статуса больного длительное время находится в поле зрения неонатологов и, в последующем, педиатров и пульмонологов. На сегодняшний день БЛД встречается преимущественно у недоношенных детей, и её частота обратно пропорциональна сроку гестации. Однако не все недоношенные дети, имеющие серьёзные факторы риска развития БЛД, в исходе формируют эту форму патологии. Установлено, что значимую роль при этом играет одновременное сочетание генетической предрасположенности и воздействия факторов окружающей среды во внутри- и внеутробном периоде развития. Эпигенетика изучает процессы влияния негенетических факторов на экспрессию различных генов без нарушения последовательности ДНК. В частности, к ним можно отнести гипоксию, гипероксию, вредные привычки и хронические болезни матери, воспаление, стресс и др. [1].

Однако только оценка факторов риска имеет ограниченную значимость. Распространённость БЛД среди недоношенных детей может снижаться благодаря прогрессивным методам респираторной поддержки, антенатальной стероидной терапии и заместительной терапии сурфактантом [2]. Тем не менее даже самые современные способы лечения часто недостаточно эффективны для крайне недоношенных детей. Такая клиническая ситуация определяет значимость инновационных подходов, поскольку другие современные методы лечения (например, кислородотерапия, бронходилататоры и глюкокортикостероиды) также имеют недостаточную эффективность у данной категории больных [3]. Существует острая потребность не только в новых, более эффективных методах лечения БЛД, но и в подходах, которые могли бы прогнозировать и потенциально выявлять новорождённых, которым необходимы таргетные или более ранние вмешательства [4]. К ним можно отнести суммарную оценку различных факторов риска, выявление новых генетических и/или биохимических маркеров и применение компьютерных технологий.

Сегодня тактика ведения детей с БЛД сфокусирована на лечении уже сформированной патологии. Однако для повышения эффективности терапии важно сконцентрироваться на выделении групп риска и отбора больных для персонифицированного профилактического подхода. Для этого активно используются различные информационные технологии, в том числе математические модели. Разработаны различные прогностические инструменты, но нет универсального. При этом существуют определённые сложности выбора временнóго интервала для оценки факторов риска. Самые ранние прогностические модели выделяют различные маркеры в первые 24 ч после рождения, однако нередко используется интервал от 2 до 7 дней жизни. Более ранняя оценка отличается меньшей точностью, а более поздняя — сокращением сроков для эффективных терапевтических вмешательств. Популярными факторами риска являются гестационный возраст, масса тела при рождении, респираторная поддержка и пол ребёнка [4]. Кроме того, активно изучается роль генетических и биохимических маркеров [5].

В связи с этим нами была проведена комплексная работа по анализу значимых факторов формирования БЛД у недоношенных детей с последующим созданием предиктивных моделей, которые могут быть использованы в клинической практике врача-неонатолога.

Цель работы — разработать модель прогнозирования и усовершенствовать комплексный подход к ведению детей с БЛД на основании выявленных клинико-лабораторных и молекулярно-генетических предикторов её формирования.

Материалы и методы

Обследовано 309 недоношенных детей, которые были распределены на 3 группы:

Проведён анализ клинических и анамнестических параметров, у 204 детей определена концентрация биомаркеров ангиогенеза в сыворотке крови.

С помощью метода иммуноферментного анализа были определены изменения концентраций следующих биомаркеров: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, молекула адгезии тромбоцитов/эндотелиальных клеток-1, тромбоцитарный фактор роста ВВ, фактор роста эндотелия сосудов А и D, тромбоспондин-1, трансформирующий фактор роста-β, интерлейкин-8, фактор роста соединительной ткани, фактор роста фибробластов-10. Затем была проведена оценка взаимосвязей между полученными лабораторными и клиническими параметрами у недоношенных детей. Анализ взаимосвязей выполняли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r), в ряде случаев был использован критерий Кендалла (τ). Интерпретацию силы связи производили с помощью шкалы Чеддока.

На следующем этапе 170 больным было проведено генетическое обследование. Качество и количество геномной ДНК оценивали при помощи спектрофотомера «NanoVue» («GE 130 Healthcare») и флуориметра «Qubit 3.0» («Invitrogen»). Для определения нечасто встречаемых нуклеотидных вариантов исследуемым пациентам было выполнено массовое параллельное секвенирование полного экзома. Набор реактивов «Ion AmpliSeq Library Kit» и панель «Ion AmpliSeq Exome» использовали с целью создания библиотек и обогащения целевыми регионами. Массовое параллельное секвенирование генетического материала детей было выполнено при помощи «Ion S5 System Thermo Fisher Scientific» с применением одинаковых реактивов. Амплификация участков изучаемых генов выполнена методом ПЦР в реальном времени на термоциклере «ABI StepOnePlus» («Applied 47 Biosystems»). Оно выполнялось у 2 групп больных: сформировавших БЛД (n = 100) и контрольной (n = 70). При анализе на основании данных полноэкзомного секвенирования были приоритетно выбраны 25 генов, которые могли быть ассоциированы с формированием БЛД. В результате дальнейшего статистического анализа были отобраны 9 генетических вариантов для последующего исследования. Далее было проведено сравнение частот встречаемости выбранных нуклеотидных вариантов с помощью ПЦР в режиме реального времени как между основной и контрольной группами, так и с базой данных частот нуклеотидных вариантов российской популяции RUSeq, что позволило дополнительно оценить генетические варианты, встречающиеся у жителей России. В результате работы были разработаны 2 прогностические модели для оценки риска формирования БЛД у недоношенных детей.

Сбор и хранение первичных данных осуществляли в пакете Microsoft Excel 2013. Статистический анализ данных выполняли с использованием программ «SPSS 25» («IBM») и «StatTech v. 4.1.7» («Статтех»).

Результаты

Клинико-анамнестические факторы, значимые для формирования бронхолёгочной дисплазии

Среди детей, сформировавших БЛД, отмечалось небольшое преобладание мальчиков (57% против 43%), которое не имело статистической значимости. Несмотря на ранее показанное в других работах преобладание пациентов мужского пола [6, 7], по данным проведённого нами анализа значимой разницы между группами больных не выявлено. Медиана гестационного возраста при рождении в группе детей с БЛД составила 28,1 [Q1; Q3 — 26,3; 29,5], что существенно (p < 0,001) больше, чем без БЛД, — 33,0 нед [30,1; 36,0]. Медиана массы тела при рождении в группе детей, сформировавших БЛД, была также значимо (p < 0,001) ниже, чем в группе детей без БЛД, — 950 г [840; 1220] против 1840 г [1380; 2600].

Таким образом, дети, сформировавшие БЛД, были рождены с меньшими показателями массы тела и гестационного возраста, что свидетельствует о преимущественном формировании данной патологии у глубоко недоношенных детей [8, 9].

Медиана оценки по шкале Aпгар также была статистически значима (p < 0,001). В группе детей, сформировавших БЛД, медиана оценки на 1-й минуте составила 5,0 баллов [4,0; 5,0], на 5-й — 6,0 [6,0; 7,0]; в группе сравнения: на 1-й минуте — 7,0 баллов [6,0; 7,0], на 5-й — 7,0 [6,0; 8,0].

Все обследованные недоношенные дети в неонатальном периоде перенесли РДС, поэтому им потребовалось проведение респираторной поддержки тем или иным способом. Кроме того, все пациенты основной группы нуждались в эндотрахеальном введении препаратов экзогенного сурфактанта при рождении. В контрольной группе этот показатель составил 78%. Медиана продолжительности общей кислородозависимости в группе детей, сформировавших БЛД, составила 49 дней (37–67), при этом в группе сравнения — всего 10 (5–20) (p < 0,001).

Таким образом, такие факторы, как гестационный возраст, масса тела при рождении, оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах жизни и продолжительность общей респираторной поддержки были определены как значимые для формирования БЛД и потенциально информативные для включения в шкалу прогнозирования.

Гены, ассоциированные с развитием бронхолёгочной дисплазии

При полноэкзомном секвенировании 100 недоношенных детей, рождённых до 37-й недели гестационного возраста и сформировавших БЛД, в результате анализа приоритизации были выбраны 25 генов: AFF2, AMH, AQP7, ARHGEF11, AUP1, CCN2, CPA3, GALR2, HTRA2, HYAL3, MAPK8IP3, MMP14, NCOR2, PPTN22, SFTPA2, TLR5, TTN, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10. Рассматриваемый генетический спектр потенциально может быть ассоциирован с формированием БЛД.

На следующем этапе было проведено сравнение встречаемости генетических вариантов, ранее ассоциированных с БЛД и выбранных в данном исследовании, у пациентов по сравнению с контрольной выборкой (70 доношенных детей без признаков бронхолёгочных заболеваний в анамнезе). Секвенирование было проведено на одном приборе и с использованием одинаковых реактивов. Статистическая значимость была найдена у 31 генетического варианта. Из них, исходя из функции гена, встречаемости генетического варианта в популяции и в нашей выборке, для дальнейшего исследования были отобраны 9 вариантов: rs12489516 (CPA3), rs2476601 (PTPN22), rs1042703 (MMP14), rs5744174 (TLR5), COSV53739696 (AFF2), rs45488997(CCN2), rs1059046 (SFTPA2), rs61519723 (NCOR2), rs62542745 (AQP7). Их распространённость достоверно отличалась в выборке больных с БЛД от контрольной. Известно, что они могут играть различную роль в патогенезе формирования БЛД. В частности, влиять на формирование иммунного ответа, развитие воспаления, структуру внеклеточного матрикса, продукцию сурфактанта, ангиогенез и трансмембранный транспорт. Например, ген CPA3 кодирует карбоксипептидазу А3. Она представляет собой специфическую протеазу тучных клеток. Повышение данного маркера наблюдается в состоянии гипероксии [10]. В рамках проведённого исследования нуклеотидный вариант rs12489516 в гене CPA3 значимо чаще встречался у пациентов, не сформировавших БЛД (р = 0,03): только у 2 больных он встретился в гетерозиготном состоянии, тогда как у всех остальных он был в гомозиготном. Таким образом, рассматриваемый нуклеотидный вариант можно отнести к протективным факторам, носители которых обладают пониженным риском формирования БЛД. По результатам статистического анализа шансы сформировать БЛД у пациентов с данным генетическим вариантом ниже в 4,7 раза (ОШ = 4,7; 95% ДИ 1,05–44,3).

Фактор роста соединительной ткани (CCN2) может также играть роль в развитии БЛД. Нами установлено, что представленность нуклеотидного варианта rs45488997 в гене CCN2 была выше у пациентов, которым была диагностирована БЛД (р = 0,023). Таким образом, рассматриваемый нуклеотидный вариант возможно отнести к факторам повышенного риска развития заболевания. Шансы развития БЛД у пациентов с выявленным генетическим вариантом выше в 1,5 раза (ОШ = 1,5, 95% ДИ 1,075–5,184).

При сравнении частот встречаемости нуклеотидных вариантов с использованием текущей выборки и общепопуляционными данными, полученными из базы данных RUSeq, установлено, что распространённость нуклеотидного варианта rs45488997 в гене CCN2 также значимо выше среди пациентов с БЛД по сравнению с общероссийской популяцией (р = 0,005). Кроме того, нуклеотидные варианты rs5744174 в гене TLR5 и rs2476601 в гене PTPN22 статистически значимо реже выявлялись у пациентов исследуемой группы по сравнению с общепопуляционными показателями (p = 0,03 и р = 0,003 соответственно), что требует их дальнейшего изучения.

Биохимические маркеры бронхолёгочной дисплазии

В сыворотке крови 204 детей методом иммуноферментного анализа были определены и сопоставлены между исследуемыми группами концентрации 11 основных биомаркеров ангиогенеза. При этом удалось определить 6 значимых маркеров для прогнозирования отсутствия развития БЛД у недоношенных детей с РДС: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, тромбоцитарный фактор роста ВВ, молекула клеточной адгезии тромбоцитов/эндотелия, факторы роста эндотелия сосудов А и D. Для некоторых ангиогенных факторов также выявлены диагностические концентрации в сыворотке крови, позволяющие подтверждать или опровергать заболевание у пациентов старше 28 сут жизни: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, тромбоцитарный фактор роста ВВ, фактор роста эндотелия сосудов А. Определённые концентрации биомаркеров ангиогенеза позволяют включить их в разработанную математическую модель прогнозирования развития БЛД у недоношенных детей с РДС.

При последующем проведении корреляционного анализа между изученными клинико-анамнестическими и лабораторными параметрами были выявлены прямые корреляции умеренной силы между гестационным возрастом, массой тела при рождении и концентрациями тромбоцитарного фактора роста в сыворотке крови и уровнем гемоглобина на момент обследования (р < 0,001); обратные корреляции умеренной силы были определены между возрастом больных на момент обследования, длительностью кислородозависимости и концентрациями ангиопоэтина-2 в сыворотке крови и уровнем гемоглобина по данным клинического анализа крови (р < 0,001).

В связи со сложностью прогнозирования развития БЛД в клинико-лабораторной практике нами были созданы две прогностические модели для определения вероятности формирования БЛД:

При создании прогностических моделей использовали пару исходов: формирование/неформирование БЛД. Построение прогностических моделей вероятности определённого исхода выполняли при помощи метода бинарной логистической регрессии. При изучении значимых клинико-анамнестических предикторов большее повышение значения площади под кривой (AUC) получено при одновременном использовании таких параметров, как гестационный возраст, масса тела при рождении, длительность ИВЛ и постоянное положительное давление в дыхательных путях (СРАР) (–0,968 ± 0,012; 95% ДИ 0,944–0,992; р < 0,001).

Наблюдаемая зависимость описывается уравнением:

P = 1 / (1 + e–z) × 100%;

z = 13,706 – 0,394 × XГВ – 0,002 × XМР + 0,151 × XИВЛ + 0,252 × XСРАР,

где P — вероятность БЛД; XГВ — гестационный возраст (нед); XР — масса тела при рождении (г); XИВЛ — ИВЛ (дни); XСРАР — СРАР (дни).

Полученная регрессионная модель является значимой (p < 0,001). Исходя из значения коэффициента детерминации Найджелкерка, модель объясняет 79,5% наблюдаемой дисперсии группы.

Оценка шансов формирования БЛД:

Другая разработанная модель прогнозирования учитывала концентрации различных маркеров ангиогенеза в сыворотке крови: VEGF-A, ANGPT2, ANGPT1, PDGF-BB и PECAM-1. Наибольшее повышение AUC получено при одновременном использовании всех предикторов (–0,957 ± 0,025; 95% ДИ 0,909–0,999; р < 0,001).

Наблюдаемая зависимость описывается уравнением:

P = 1 / (1 + e–z) × 100%;

z = 7,359 – 0,01 × XVEGF-A + 0,00052 × XANGPT2 – 0,00026 × XANGPT1 – 0,0003 × XPDGF-BB – 0,000404 × XPECAM-1,

где P — вероятность БЛД; XVEGF-A — концентрация VEGF-A (пг/мл); XANGPT2 — концентрация ANGPT2 (пг/мл); XANGPT1 — концентрация ANGPT1 (пг/мл); XPDGF-BB — концентрация PDGF-BB (пг/мл); XPECAM-1 — концентрация PECAM-1 (пг/мл).

Полученная регрессионная модель является статистически значимой (p < 0,001). Исходя из значения коэффициента детерминации Найджелкерка, модель объясняет 79,4% наблюдаемой дисперсии группы.

Оценка шансов формирования БЛД:

Данные значения статистической точности прогноза являются достаточно хорошими. В дальнейшем они были апробированы в клинической практике, что дополнительно подтвердило теоретические расчёты. В связи с этим возможно использование полученных моделей для прогнозирования формирования БЛД у недоношенных детей.

Обсуждение

В нашей работе самыми значимыми клиническими маркерами формирования БЛД были определены гестационный возраст, масса тела при рождении, оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах жизни и продолжительность общей респираторной поддержки. Полученные результаты согласуются с общемировым опытом [11]. Данные показатели могут использоваться для оценки риска в первые часы жизни ребёнка и достаточно широко применяются для создания компьютерных моделей [12]. Кроме того, они не требуют наличия высокотехнологичной медицинской помощи и могут быть интегрированы в работу любого акушерско-гинекологического стационара. Мужской пол как фактор риска формирования БЛД не нашел подтверждения в рамках проведённой работы. Различные более ранние публикации по изучению БЛД поддерживали данный тезис, однако современные тенденции изменились [9]. В настоящее время мужской пол не может быть рассмотрен как независимый предиктивный показатель [13]. Хотя при обработке данных наблюдалась соответствующая тенденция, она не была статистически значимой. При глубоком изучении различных фенотипов и эндотипов БЛД половая принадлежность больного, возможно, будет иметь какие-либо ассоциации, которые требуют дальнейшего изучения.

При изучении биомаркеров в сыворотке крови больных были исследованы 11 различных факторов ангиогенеза, которые потенциально могут играть роль в формировании БЛД. По данным анализа с точки зрения значимости для клинической практики определены следующие маркеры: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, тромбоцитарный фактор роста ВВ, молекула клеточной адгезии тромбоцитов/эндотелия, а также фактор роста эндотелия сосудов А. Они показали высокую предиктивную ценность. В мировой практике ведётся активное изучение механизмов ангиогенеза, эндотелиальной и тромбоцитарной функции у новорождённых, особенно недоношенных [14]. Это связано с тем, что как изменения формирования сосудистого русла, так и его повреждения нарушают процесс альвеоляризации. Таким образом, эндотелиально-эпителиальное взаимодействие играет одну из ключевых ролей в формировании нормальной лёгочной ткани. Этот процесс имеет значимые патофизиологические особенности и различия по сравнению со взрослыми [15]. В целом, изучение данной группы показателей представляет интерес с точки зрения не только ранней диагностики, но и их использования для динамического мониторинга группы риска и последующей повторной оценки [16].

При обследовании генетических профилей пациентов в рамках проведённой работы также выделены нуклеотидные профили, которые могут быть рассмотрены как маркеры высокого риска, а некоторые — как факторы, способствующие снижению заболеваемости. Однако на текущем этапе их использование для предиктивной оценки невозможно, т. к. важную роль играет не только наличие определённого генетического варианта, но и степень его экспрессии, которая может варьировать в различных условиях [17].

Математические модели комплексной оценки состояния недоношенных новорождённых позволяют достаточно быстро определять наиболее уязвимую группу по риску формирования БЛД, исключая субъективные факторы со стороны медицинских работников. Такие вспомогательные технологии позволяют создать максимально персонифицированный подход. В нашей работе были созданы 2 модели. Первая представляет собой комплексную оценку только клинических показателей, которая не требует наличия специализированного оборудования в условиях стационара и может применяться в первые дни жизни недоношенного новорождённого. Вторая модель является более сложной с точки зрения необходимости определения конкретных лабораторных показателей, которые не интегрированы в рутинную практику. Однако создание подобных моделей также необходимо, т. к. позволяет глубже понять патогенез заболевания и со временем стандартизировать самые значимые маркеры. В дальнейшем такой подход позволит разработать комбинированную клинико-лабораторную модель с ещё большей прогностической значимостью.

Заключение

БЛД является распространённой формой патологии среди недоношенных детей и нередко приводит к ранней и тяжёлой инвалидизации больного. Лечение данного заболевания — это значимая финансовая нагрузка как на систему здравоохранения, так и на родителей пациентов. Разработка современных прогностических моделей и ранняя профилактика БЛД — это перспективный метод для эффективной помощи недоношенным новорождённым.

Суммарная оценка факторов риска позволила разработать две прогностические модели, которые могут быть интегрированы в клиническую практику неонатального и педиатрического стационаров, что поможет в таргетной профилактической и лечебной тактике ведения больных на этапе формирования и течения БЛД.