Changes in calcium homeostasis in motor neurons differentiated from induced pluripotent stem cells in patients with spinal muscular atrophy

Abstract

Актуальность. Создание экспериментальных клеточных моделей спинальной мышечной атрофии (СМА) на основе пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) является актуальной задачей для изучения селективной гибели СМА-мотонейронов. Считается, что СМА-мотонейроны высокочувствительны к основному возбуждающему нейромедиатору в центральной нервной системе — глутамату, который в высоких концентрациях вызывает гиперактивацию NMDA-рецепторов, нарушение гомеостаза кальция и гибель нейронов. С другой стороны, внутриклеточный кальциевый сигналлинг играет ключевую роль в экспрессии гена SMN2.

Цель работы: провести анализ кальциевого гомеостаза мотонейронов, полученных путём нейрональной дифференцировки из ИПСК больных СМА.

Материалы и методы. Для многоступенчатой дифференцировки использовали пациент-специфичную линию ИПСК с мутацией в гене SMN1 от больных СМА типа II (m3SMA20) и линию ИПСК здорового донора FF1S (группа контроля) с добавлением малых молекул в ростовые среды: СHIR99021, Dorsomorphin, SB431542, ретиноевая кислота, purmorphamine, вальпроевая кислота и DAPT. Полученная гомогенная культура мотонейронов была фенотипирована иммуноцитохимическим методом на нейрональные маркёры OLIG2, ISL1 и ChAT. Анализ внутриклеточной концентрации кальция ([Сa²⁺]_i) и измерение митохондриального потен­циала (ΔΨm) проводили при помощи флуоресцентной микроскопии с использованием Fura2 (Ex 340/380 нм/Em 525 нм) и Rh123 (Ex 485 нм/Em 525 нм).

Результаты. В ответ на глутамат (300 мкМ) СМА-мотонейроны отвечали слабым повышением [Сa²⁺]_i по сравнению с контролем. Кроме того, СМА-мотонейроны медленнее восстанавливали исходную [Сa²⁺]_i в постглутаматный период, что свидетельствует о митохондриальной дисфункции. Воздействие L-глутамата (300 мкМ) не приводило к синхронному падению ΔΨm и отсроченной кальциевой дизрегуляции в контрольных мотонейронах, следовательно, данная концентрация не является токсической для дифференцированных мотонейронов. Таким образом, различия в ответе на глутамат могут быть связаны с дефектной работой глутаматных рецепторов. Это согласуется с тем, что при дефиците белка SMN наблюдается нарушение метаболизма L-глутамата, ослабление глутаматергической нейропередачи и снижение количества возбуждающих глутаматных синапсов в спинном мозге.

Заключение. Мотонейроны, дифференцированные из пациент-специфичной линии ИПСК с мутацией в гене SMN1 от больных СМА типа II (m3SMA20) подвержены раннему нарушению кальциевого гомеостаза, что может свидетельствовать о низкой экспрессии главной активирующей субъединицы NMDA-рецепторов — NR2A.