Особенности функционирования глутаматных рецепторов мотонейронов при спинальной мышечной атрофии

Актуальность. Спинальная мышечная атрофия (СМА) — наследственное нервно-мышечное заболевание, приводящее к прогрессирующей гибели мотонейронов (МН). Для исследования молекулярных механизмов прогрессирования СМА и тестирования веществ, обладающих свойствами нейропротекции, необходимы клеточные модели СМА, наиболее релевантными из которых являются модели на основе пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Цель: определить нарушения кальциевого гомеостаза и митохондриальной дисфункции СМА МН, полученных из пациент-специфичных ИПСК.

Материалы и методы. В работе были использованы пациент-специфичная линия ИПСК от больного с СМА 2-го типа (m3SMA20) и линия от здорового донора (FF1S). Дифференцировку в спинальные МН осуществляли по протоколу с DUAL SMAD ингибированием. Мотонейрональный фенотип был подтверждён иммуноцитохимическим анализом экспрессии маркёров OLIG2, Isl1, ChAT, βIII-тубулина. Стимуляцию дифференцированных МН проводили агонистами глутаматных рецепторов. Функционирование ионотропных глутаматных рецепторов МН оценивали по изменению цитозольной концентрации кальция ([Ca²⁺]_i) при их стимуляции. Кальциевые ответы и митохондриальный потенциал регистрировали при помощи Fura-2 и Rh123 соответственно.

Результаты. Полученные МН экспрессировали ацетилхолинтрансферазу и глутаматные рецепторы. При стимуляции СМА МН 500 мкМ глутаматом натрия (Glu) наблюдали более слабый подъём [Ca²⁺]_i по сравнению с контрольной группой. При селективной стимуляции метаботропных (mGluR) и амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионат/каинатных рецепторов (AMPAR/KAR) не обнаружили кальциевого ответа в СМА МН, что указывает на их функциональную инактивацию, а при избирательной стимуляции N-метил-D-аспартатных рецепторов (NMDAR) больные МН характеризовались более слабым кальциевым ответом. При воздействии Glu на СМА МН в присутствии антагониста NMDAR — дизоцилпина (MK801) уровень повышения [Ca²⁺]_i в СМА МН был минимальным, что подтверждает главную и, возможно, единственную роль NMDAR в глутаматергической нейротрансмиссии СМА МН. Данные нарушения сопровождались более низкой скоростью восстановления базальной [Ca²⁺]_i в постглутаматный период в присутствии ЭГТА, что косвенно свидетельствует о низком уровне АТФ в СМА МН. При помощи индуктора митохондриальной деполяризации FCCP обнаружили более низкую кальций-депонирующую ёмкость митохондрий в СМА МН, вероятно, по причине низкого митохондриального потенциала. Дополнительно зафиксировали митохондриальную деполяризацию в СМА МН при стимуляции нетоксической дозой Glu, использованной в работе, что, по всей видимости, является следствием митохондриальной дисфункции.

Заключение. СМА МН, полученные из пациент-специфичных ИПСК, демонстрируют нарушения кальциевого гомеостаза и функций митохондрий. Основной вклад в кальциевый ответ на Glu больных МН вносят NMDAR. Эти изменения отражают ключевые патогенетические механизмы заболевания и свидетельствуют о значимости ИПСК-модели для доклинических исследований и разработки таргетной терапии.