Алгоритм иммунологического обследования детей с иммунозависимыми заболеваниями для прогноза эффективности биологической терапии

Введение

Для лечения иммунозависимых заболеваний (ИЗЗ) успешно применяются генно-инженерные биологические препараты (ГИБП). Широкий спектр ГИБП открывает возможности для реализации персонализированного подхода при лечении ИЗЗ. В этой связи актуальной становится разработка методов прогнозирования эффективности биологической терапии для своевременной оптимизации лечения. Интенсивно исследуются как лабораторные, так и клинические биомаркеры для оценки эффекта биологической терапии. Под биомаркером понимают объективно измеряемый показатель, который служит индикатором нормальных физиологических, патологических процессов или реакций на терапевтическое вмешательство [1]. Биомаркеры подразделяют на подтипы, ассоциированные с мониторингом состояния, прогнозом течения болезни и ответом на лечение [2]. Установлена связь между повышенным индексом массы тела и сниженным ответом на терапию адалимумабом (ADA) у больных воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) [3]. Описаны новые серологические маркеры, демонстрирующие положительную корреляцию с эффективностью лечения при ВЗК (такие как ST2 — рецептор к интерлейкину (ИЛ)-33), а также информативность для мониторинга активности воспаления (S00А12 — провоспалительный кальцийсвязывающий белок; фекальный лактоферрин; матриксная металлопротеиназа-9) [4].

У больных псориазом (ПС) выявлены корреляции между индексом распространённости и тяжести ПС PASI (Psoriasis Area and Severity Index) и концентрациями интерферон-γ (ИФН-γ), ИЛ-13 [5]. В качестве предикторов ответа на биологическую терапию авторы предлагают использовать соотношение ИФН-γ/ИЛ-13, ИЛ-17A/ИЛ-13, ИФН-γ/ИЛ-4 и ИЛ-17A/ИЛ-4 [5].

При рассеянном склерозе (РС) в качестве прогностического биомаркера рассматриваются концентрации нейрофиламентов, повышение уровня которых ассоциировано с активностью болезни и позволяет предсказать ответ на терапию [6]. У больных РС прогностическое значение для оценки активности заболевания имел индекс, рассчитываемый как отношение концентрации хемокина CXCL13 в ликворе к его уровню в сыворотке крови, нормализованное на соотношение альбумина в ликворе и сыворотке [2]. Больные с впервые диагностированным РС, высоким положительным индексом нуждались в назначении более агрессивной терапии [2].

Особое внимание уделяется биомаркерам, позволяющим прогнозировать эффект терапии до её начала. У больных с псориатическим артритом установлена высокая прогностическая значимость исходного уровня комплекса маркёров, включающего мембранно-ассоциированные молекулы и растворимые белки (хемокин CXCL10, матриксная миелопероксидаза 3, S100 кальций-связывающий белок A8, кислая фосфатаза 5), в отношении ответа на терапию ингибиторами фактора некроза опухоли (ФНО) [7].

Прогностическая информация может быть получена также при анализе содержания клеточных популяций. Для предсказания эффективности ингибиторов ФНО (инфликсимаб (IFX)/ADA) и ведолизумаба (гуманизированное моноклональное антитело против α₄β₇-интегрина — VDZ) у больных с ВЗК оценивался комплексный индекс, основанный на содержании IgG-плазмоцитов, воспалительных моноцитов, активированных Т-лимфоцитов и стромальных клеток [7].

При болезни Крона определялся баланс между субпопуляциями Т-хелперов (Treg, Th1 и Th17) и выявлено, что соотношения Treg/Th1 и Treg/Th17 могут служить потенциальными предикторами рецидива болезни Крона [8]. Ранее нами была показана информативность определения различных иммунных показателей, таких как содержание популяций лимфоцитов, в том числе малых (Th17, Treg) [9], популяций миелоидных клеток-супрессоров (MDSCs) [10], Т-клеток памяти [11], изменений метаболической активности лимфоцитов (активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), экспрессия эктонуклеотидазы CD39 на Treg) [12], а также уровней ядерного фактора κB (NF-κB) в популяциях лимфоцитов у больных с ВЗК, ПС и РС для оценки активности воспалительного процесса [13].

Работ по использованию комплекса биомаркеров для прогноза эффективности ГИБП у детей недостаточно. M. Cattalini и соавт. выявили, что уровни матриксной металлопротеиназы-3, ИЛ-6 и ИЛ-10 могут прогнозировать исход терапии ювенильного идиопатического артрита через 6 и 12 мес. Более высокая концентрация ИЛ-6 предсказывала быстрое наступление рецидива синовиального воспаления, а увеличение уровня ИЛ-10 — большую продолжительность эффекта применения кортикостероидов [14].

Цель работы: разработать алгоритм иммунологического обследования у детей с ВЗК, ПС, РС для прогноза эффективности ГИБП.

Материалы и методы

Проведено комплексное иммунологическое обследование больных с ВЗК, ПС и РС на терапии ГИБП (табл. 1). Возраст детей, включённых в исследование, составил от 3,5 до 18 лет. Протокол исследования был одобрен независимым локальным этическим комитетом. Родители пациентов дали письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Больные получали ГИБП согласно рекомендованным схемам: дети с ВЗК — блокаторы ФНО (IFX в дозе 5–10 мг/кг каждые 6–8 нед, ADA в дозе 40 мг каждые 1–2 нед); пациенты с ПС — ADA (в дозе 40 мг каждые 1–2 нед); больные РС — ИФН-β1α в дозе 22 мкг/44 мкг 3 раза в неделю. Комбинированную терапию с азатиоприном получали 80% пациентов с ВЗК на терапии IFX, 46% больных ВЗК на терапии ADA. Терапию с добавлением метотрексата получали 45% детей с псориазом на ADA. Больные были распределены на группы «обострение/ремиссия» в зависимости от индексов клинической активности и функциональных исследований: группа детей с ВЗК в ремиссии — индексы PCDAI (Pediatric Crohn’s Disease Activity Index)/PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index) — ≤ 10 и состояние эндоскопической ремиссии; группа с ВЗК в обострении — индексы PCDAI/PUCAI > 10 и эндоскопическое обострение; пациенты с псориазом — индекс PASI (Psoriasis Area and Severity Index) — ≤ 10 — ремиссия, > 10 — обострение; больные РС — с контрастнегативными очагами демиелинизации на МРТ (ремиссия), с контрастпозитивными очагами демиелинизации (обострение).

Эффективность ГИБП у больных оценивали к году терапии. Группа с хорошим эффектом включала пациентов, у которых к году терапии наблюдались: для ВЗК —индексы PCDAI/PUCAI ≤ 10 с эндоскопической ремиссией, для ПС — достижение PASI 75, для РС — клиническая ремиссия и отсутствие активных очагов на МРТ. В группу с недостаточным эффектом входили больные, у которых к году терапии для ВЗК — индексы PCDAI/PUCAI были > 10 c эндоскопическим обострением, для ПС — недостижение PASI 75, для РС — клиническое обострение и наличие активных очагов на МРТ. Группу сравнения составили 100 условно здоровых детей, сопоставимых по возрасту.

У всех больных определяли следующие иммунологические показатели: содержание основных (Т-, В-, NK-клеток) и малых популяций лимфоцитов (Т-регуляторных (Treg), Th17-лимфоцитов, активированных Т-хелперов), популяций CD4⁺-Т-клеток памяти (клетки центральной памяти — TCM, эффекторной — TEM, терминально-дифференцированной — TEMRA), популяций CD8⁺-Т-клеток памяти (клетки центральной памяти — TcytCM, эффекторной — TcytEM, терминально-дифференцированной — TcytEMRA), популяции миелоидных клеток супрессоров (М-MDSCs — моноцитарные и G-MDSCs — гранулоцитарные), содержание Treg и Th17-лимфоцитов с экспрессией эктонуклеотидазы CD39, активность СДГ в популяциях лимфоцитов, содержание лимфоцитов с транслокацией ядерного фактора kB (NF-κB). Оценку иммунологических показателей у пациентов проводили на разных этапах лечения ГИБП: до назначения терапии, после индукционного курса, к году терапии.

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови проводили методом проточной цитометрии (Novocyte, «ACEA Biosciences»). Использовали моноклональные антитела, конъюгированные с различными флюорохромами: CD4-FITC («Beckman Coulter»), CD127-PE («Beckman Coulter»), CD25-PC7 («Beckman Coulter»), CD161-PE («Beckman Coulter»), CD3-PC5 («Beckman Coulter»), CD3-PC5 («Beckman Coulter»), CD39-APC-Cy7 (Clone A1, «Sony Biotechnology»), СD11 CD33-APC-Cy7 (Clone A1, «Sony Biotechnology»), CD14-APC-Cy7 (Clone AD2, «Sony Biotechnology»), CD15-APC-Cy7 (Clone A1, «Sony Biotechnology»). Для выделения популяций применяли тактику пошагового гейтирования: Treg (CD4⁺CD25^highCD127^low), Th17-лимфоцитов (CD4⁺CD161⁺CD3⁺) c экспрессией CD39. Активность СДГ в популяциях клеток оценивали по изменению показателя бокового светорассеяния методом проточной цитометрии [15]. Содержание общей популяции MDSCs в образце определяли в «лимфоидно-моноцитарном» регионе по следующим маркерам: (CD3, CD19, CD56, HLA-DR)^-CD11b⁺CD33⁺, моноцитарную и гранулоцитарную популяции определяли по наличию CD14⁺ и CD15⁺ соответственно. Уровень транслокации NF-κB в популяциях лимфоцитов оценивали с помощью коммерческого набора «Amnis NF-κB Translocation Kit» («Luminex») методом проточной цитометрии с визуализацией («Amnis ImageStreamX Mk II»).

Статистическая обработка данных проведена в программе «Statistica v. 10.0» («StatSoft»). Диагностическую и прогностическую значимость исследуемых параметров, уровень пороговых значений (cut-off) оценивали с помощью метода характеристических кривых (ROC- receiver operator characteristic) на основании анализа площади под кривой (AUC), специфичности (Sp) и чувствительности (Se) в программе SPSS 16.0 («IBM»). Проверку прогностической информативности выявленных биомаркеров проводили на двух внутренних и одной внешней выборках в динамике терапии. Внутренняя выборка включала каждого 3 больного с известным эффектом к году лечения ГИБП (ВЗК — 744 наблюдения, РС — 89 наблюдений), внешняя выборка состояла из 37 пациентов с вульгарным псориазом старше 12 лет (97 наблюдений) на терапии устекинумабом (UST — анти IL-12/23), проводимой согласно рекомендованным дозам (подкожно на 0-й и 4-й неделях и далее каждые 12 нед в дозе 0,75 мг/кг веса или при массе тела ребёнка от 60 до 100 кг — 45 мг).

Вероятность хорошего прогноза (SeP) определяли по частоте верно предсказанных истинно положительных результатов (TP) из общего числа (TP и ложноотрицательные — FN) по формуле [16]:

Частоту верно предсказанных истинно отрицательных результатов (SeN) определяли по формуле:

где TN — число верно предсказанных истинно отрицательных результатов; FP — число ошибочно предсказанных как положительные результатов. Вероятность прогноза эффекта терапии для иммунологических показателей считали высокой при частоте правильных прогнозов ≥ 70%.

Результаты

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от индекса Th17/Treg

Анализ содержания основных и малых популяций лимфоцитов показал информативность соотношения Th17-лимфоцитов к Treg для оценки эффективности терапии при исследованных формах патологии (ВЗК, ПС, РС).

При значениях индекса Th17/Treg выше указанных в табл. 2 можно прогнозировать неэффективность терапии к году лечения ГИБП у больных ВЗК, ПС и РС. Выявлена информативность индекса Th17/Treg (с вероятностью прогноза > 70%) для пациентов с ВЗК в течение года терапии независимо от возраста и применяемого препарата, для больных ПС старше 12 лет — на терапии ADA и UST в течение года лечения, у пациентов с РС старше 12 лет — до начала терапии ИФН-β1α.

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от абсолютного содержания регуляторных клеток (сумма MDSCS и Treg)

Анализ содержания регуляторных клеток показал, что наибольшие пороговые значения абсолютного содержания Reg-клеток (MDSCS и Treg), выше которых можно прогнозировать хороший ответ ГИБП, выявлены у больных ВЗК — 213 кл/мкл (AUC = 0,813, Se/Sp — 71/71%), наименьший у больных РС — 117 кл/мкл (AUC = 0,819, Se/Sp — 69/80%). У пациентов с ПС пороговое значение для Reg-клеток составило 145 кл/мкл с хорошим качеством разделительной модели (AUC = 0,714, Se/Sp — 64/67%). При снижении Reg-клеток ниже полученных пороговых значений можно прогнозировать недостаточную эффективность ГИБП у больных с ИЗЗ.

Высокая вероятность прогноза эффекта ГИБП в зависимости от пороговых значений Reg-клеток получена для боьных ВЗК до назначения терапии и во время поддерживающего курса терапии блокаторами ФНО, у пациентов с ПС на терапии UST/ADA — к году терапии, у больных РС– до назначения и к году терапии ИФН-β1α.

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от содержания наивных Т-клеток и Т-клеток памяти

При ROC-анализе получено очень хорошее качество для разделительной модели «эффективность — неэффективность» по содержанию наивных CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток и Т-клеток памяти у больных ВЗК, ПС и РС и определены их пороговые значения (рис. 1).

Также получено хорошее и очень хорошее качество разделительной модели (AUC; сut-off %, Se/Sp, %) для пациентов с ПС по показателям TCM (0,765; 22%, 77/68%) и TEM (0,819; 13%, 74/74%), а также отличное качество для больных РС по содержанию популяции TcytNAIVE (0,903; 42%, 93/75%).

У больных ВЗК, ПС и РС превышение показателей полученных пороговых значений для наивных Т-клеток прогнозирует хороший ответ на терапию ГИБП, а превышение пороговых значений для Т-клеток памяти — недостаточный ответ на терапию.

Оценка вероятности прогноза эффекта терапии ГИБП в зависимости от содержания наивных Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти показала высокую вероятность (75–90%) предсказания эффекта терапии ГИБП во время поддерживающего курса: у больных ВЗК — для популяций TNAIVE и TCM; у пациентов с ПС — для популяций TNAIVE, TCM, TEM; у больных РС — для популяций TEM, TcytNAIVE, TcytEMRA.

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от активности СДГ в Treg и индекса Th17/Treg

Получены пороговые значения для активности СДГ в Treg, ниже которых можно прогнозировать недостаточную эффективность терапии ГИБП у пациентов с ИЗЗ до назначения ГИБП и в период поддерживающего курса (табл. 3).

Наименьшее значение СДГ в Treg — 182 усл. ед. (у больных ПС) использовали для проверки вероятности прогноза эффекта ГИБП при исследованных формах патологии (ВЗК, ПС и РС). Выявлена высокая вероятность правильного прогноза для пациентов с ВЗК на терапии блокаторами ФНО (74%) и у больных ПС (80%) на терапии ADA/UST. Определена также высокая вероятность предсказания эффекта терапии при использовании комплекса пороговых значений СДГ в Treg и индекса Th17/Treg у пациентов с ВЗК в группах 6–12 лет (90%) и старше 12 лет на терапии блокаторами ФНО (84%), у больных ПС на терапии ADA/UST, а также у пациентов с РС (70%) на терапии ИФН-β1α.

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от содержания Treg c экспрессией эктонуклеотидазы CD39

Проведённый ROC-анализ показал очень хорошее качество разделительной модели «эффективность — неэффективность» по относительному содержанию Treg c экспрессией эктонуклеотидазы CD39 (CD39Treg) у больных ИЗЗ в период поддерживающего курса терапии ГИБП (рис. 2).

Снижение относительного содержания CD39Treg ниже пороговых значений в период поддерживающего курса терапии ГИБП прогнозирует недостаточную эффективность терапии ГИБП у больных ИЗЗ.

Проведённая проверка предсказывания эффекта биологической терапии в период поддерживающего курса лечения в зависимости от содержания Treg с экспрессией CD39 показала высокую вероятность прогноза у больных с исследованными формами патологии (83–94%).

Прогнозирование эффекта ГИБП в зависимости от содержания NK-клеток с транслокацией NF-κB

Анализ содержания основных популяций лимфоцитов показал достоверно более высокие значения активности NF-κB у больных при обострении заболевания, чем в группе сравнения: у больных ВЗК и ПС, по всем исследованным популяциям, кроме В-лимфоцитов, у больных РС — во всех популяциях, кроме В-лимфоцитов и активированных Т-хелперов (Thact) (табл. 4).

В ремиссии заболевания активность NF-κB при изученных формах патологии относительно группы сравнения была сравнима или ниже в отдельных популяциях лимфоцитов и только при ВЗК — выше в популяции CD4⁺-Т-клеток (табл. 4). У больных ВЗК и ПС активность NF-κB была значимо выше у больных с обострением по сравнению с ремиссией заболевания во всех изученных популяциях лимфоцитов (табл. 4). У больных РС различия между группами больных в обострении и ремиссии заболевания по активности NF-κB наблюдались для популяций CD4⁺-Т-лимфоцитов и NK-клеток.

ROC-анализ показал очень хорошее и отличное качество разделительной модели «обострение — ремиссия» по содержанию лимфоцитов с транслокацией NF-κB для исследованных форм патологии по NK-клеткам и позволил определить пороговые значения, выше которых можно прогнозировать активность воспалительного процесса, а также снижение эффективности ГИБП у больных ВЗК, ПС и РС (рис. 3). Проверка пороговых значений содержания NK-клеток с транслокацией NF-κB в прогнозе активности воспалительного процесса показала высокую вероятность правильных прогнозов (> 70%) для больных ВЗК, ПС и РС.

Алгоритм иммунологического обследования у детей с ВЗК, ПС и РС для прогноза эффективности ГИБП и активности воспалительного процесса

На основании полученных информативных иммунологических показателей (индекса Th17/Treg, суммы абсолютного количества MDSCs и Treg, активности СДГ в Treg, содержания CD39Treg, уровня транслокации NF-κB в NK-клетках), позволяющих с высокой вероятностью прогнозировать эффект биологической терапии и активность воспалительного процесса, разработан алгоритм иммунологического обследования больных ВЗК, ПС и РС (рис. 4).

Алгоритм иммунологического обследования включает оптимальный набор тестов, которые рекомендуется проводить у больных ВЗК, ПС и РС до назначения (I этап) и во время поддерживающего курса терапии ГИБП (II этап). До начала биологической терапии всем больным ВЗК, ПС, РС необходимо исследование иммунофенотипа лимфоцитов с оценкой содержания Th17-лимфоцитов, Treg-клеток и индекса Th17/Treg. Превышение возрастных пороговых значений индекса Th17/Treg прогнозирует высокий риск неэффективности терапии, таким больным целесообразно назначать дополнительные тесты по оценке активности СДГ в Treg иммуноцитохимическим методом, которые повышают вероятность прогноза.

Во время поддерживающего курса ГИБП всем больным ВЗК, ПС и РС целесообразно проведение комплексного иммуноцитохимического исследования с оценкой индекса Th17/Treg и активности СДГ в Treg. При получении у больных значений индекса Th17/Treg, превышающих возрастные пороговые значения, характерные для определённой формы патологии (ВЗК, ПС, РС), а также активности СДГ в Treg ниже 182 усл. ед., можно прогнозировать ускользание эффекта ГИБП. В сомнительных случаях, например, при индексе Th17/Treg в пределах возрастного диапазона, активности СДГ в Treg < 182 усл. ед., рекомендуется назначение теста по оценке активности фактора транскрипции NF-κB в популяции NK-клеток для определения активности воспалительного процесса в данный момент. При невозможности проведения данного теста (отсутствие необходимого оборудования) рекомендуется проводить уточняющие тесты по выявлению:

1. относительного содержания Treg с экспрессией CD39;
2. относительного содержания популяций Т-клеток памяти: TNAIVE и TCM — у больных ВЗК; TEM, TCM, TEM — у пациентов с ПС; TEM, TcytNAIVE, TcytEMRA — у больных РС;
3. абсолютного содержание Reg-клеток (MDSCs+Treg).

Обсуждение

Заболеваемость ИЗЗ неуклонно растёт — аутоиммунными заболеваниями болеет каждый 10-й взрослый человек [17]. Дебют ИЗЗ в детском возрасте происходит у 4–5% больных РС, у 15–20% больных ВЗК, у 30–50% больных ПС [20–22]. В патогенезе ИЗЗ немаловажную роль играют клетки как врождённой, так и адаптивной иммунной системы [22–24]. Показана значимость баланса Th17-лимфоцитов и Т-регуляторных клеток и информативность их определения для оценки тяжести патологического процесса и эффективности биологической терапии при ИЗЗ, включая ВЗК, ПС и РС [9, 25–27]. Баланс Th17-лимфоцитов и Treg контролируется различными иммунными механизмами, цитокинами и метаболическими процессами в клетках [28]. Для получения энергии Th17-лимфоциты используют в большей степени гликолиз, чем процессы окислительного фосфорилирования, а также синтез жирных кислот. В то же время в метаболизме Treg преобладают процессы окислительного фосфорилирования и окисления жирных кислот и в меньшей степени — гликолиз [29, 30]. Нарушения метаболических путей значимо изменяются при различных формах аутоиммунной патологии [31, 32]. Кроме того, на баланс Th17 и регуляторных Т-лимфоцитов влияют экспрессирующиеся на поверхности клеток эктонуклеотидазы. При воспалении из повреждённых клеток образуется в большом количестве внеклеточный АТФ, который активирует дифференцировку Th17-лимфоцитов [33]. Эктонуклеотидазы CD39 и CD73 катализируют метаболизм АТФ до аденозина [34, 35]. Активно изучаются миелоидные клетки-супрессоры, которые, с одной стороны, оказывают ингибирующее воздействие на клетки-эффекторы, а с другой стороны, стимулируют увеличение количества Treg [36–38]. Иммунная память обеспечивает иммунный гомеостаз, способствуя быстрому и эффективному ответу Т-клеток при повторном контакте с антигеном. Нарушение баланса между популяциями Т-клеток памяти и Treg приводит к прогрессированию различных форм патологии, включая аутоиммунные заболевания [39, 40]. Важную роль в иммунной регуляции адаптивного иммунитета и иммунной толерантности, баланса между эффекторными и регуляторными клетками играет NF-κB [41, 42]. Treg могут ингибировать активность других иммунных клеток, активируя путь NF-κB, поддерживая иммунный баланс и аутотолерантность [43].

Широкое распространение для лечения ИЗЗ получили ГИБП, действие которых направлено на ингибирование пролиферации, миграции эффекторных Т-клеток, а также блокирование различных цитокинов (ФНО, ИЛ-17, -12 и -23, интегринов и др.). Несмотря на успешность применения ГИБП, у части больных возникает первичная и вторичная резистентность к препаратам, как это описано, например, при ВЗК [44, 45]. Понимание патогенетических путей развития ИЗЗ, раннее выявление больных с резистентностью к ГИБП, прогнозирование риска потери ответа на терапию позволит вовремя скорректировать терапию и снизить затраты на дорогостоящее лечение.

Разработанный алгоритм иммунологического обследования больных ИЗЗ позволяет прогнозировать ответ на терапию ГИБП и разработать индивидуальный план ведения пациента. Список разрешённых ГИБП для лечения больных ИЗЗ постоянно расширяется. Поэтому в перспективе алгоритм иммунологического обследования может быть дополнен другими информативными биомаркерами. Известно о пластичности популяций CD4⁺-Т-клеток и редифференцировке их в различные субпопуляции [46]. Описана двойная популяция Th17/Th1-лимфоцитов в инфильтратах воспалённой ткани, полученной от больных ВЗК и РС, обладающая более выраженными патогенными свойствами по сравнению с классическими Th17-клетками. Популяция Th17/Th1 может стать новым биомаркером при оценке активности воспалительного процесса и прогноза эффективности биологической терапии [47, 48].