Contribution of metabotropic glutamate receptors to changes in intracellular calcium in primary neuroglial culture

Abstract

Актуальность. Перинатальный инсульт, произошедший в период беременности, родов или в первые месяцы жизни, может привести к широкому спектру повреждений, включая двигательные нарушения, речевые расстройства, когнитивные нарушения и эпилептические припадки. Выраженности этих нарушений может варьировать от незначительных задержек развития до тяжёлой инвалидности. Гиперактивация ионотропных глутаматных рецепторов (iGluRs) является одним из ключевых механизмов, лежащих в основе патогенеза инсульта. Недавно установлено, что активность iGluRs может регулироваться метаботропными глутаматными рецепторами (mGluRs), которые стимулируются вместе с iGluRs. Цель: идентифицировать кальциевые сигналы mGluRs первого типа, вызывающие высвобождение Ca²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и определить их вклад в изменения внутриклеточной концентрации свободного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) при совместной активации iGluRs и mGluRs.

Материалы и методы. Нейроглиальные культуры получали из новорождённых крысят линии Вистар и использовали для флуоресцентно-микроскопических измерений на 11–12 DIV. Изменения [Ca²⁺]_i регистрировали на микроскопе «Nikon Ti-2», используя Са²⁺-индикатор «Fura-2» в буфере, содержащем (мМ): 130 NaCl, 5 KCl, 20 HEPES*Na, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 5 глюкозы, pH 7,4. Для оценки вклада индуцированных глутаматом сигналов mGluRs в общее повышение [Ca²⁺]_i использовали бескальциевый буфер (Ca²⁺ был замещён 0,1 мМ EGTA) и ингибитор эндоплазматической Ca²⁺-АТФазы тапсигаргин (2,5–5,0 мкМ) для истощения запасов Ca²⁺ в люмене ЭПР. Работа выполнена в соответствии с государственным заданием FGFU-2022-0012.

Результаты. При действии Glu (100 мкМ) около 90% клеток отреагировали быстрым увеличением [Ca²⁺]_i. При повторном добавлении Glu, но в бескальциевом буфере, у большинства клеток наблюдался гораздо меньший транзиторный подъём [Ca²⁺]_i. Возвращение клеткам Ca²-содержащей среды приводило к резкому подъёму [Ca²⁺]_i, свидетельствуя об активации механизмов восполнения Ca²⁺-депо ЭПР. У 5–10% клеток Glu вызывал колебательные изменения [Ca²⁺]_i, что косвенно свидетельствует об экспрессии рецепторов первого типа mGluR5. Обработка тапсигаргином снижала Glu-индуцированный подъём [Ca²⁺]_i в бескальциевом буфере, подтверждая истощение кальциевых депо ЭПР.

Заключение. Применение Glu и тапсигаргина в бескальциевом буфере позволяет идентифицировать вклад mGluRs в общее изменение [Ca²⁺]_i^._. В среднем вклад Са²⁺, высвобождаемого из ЭПР при совместной активации iGluRs и mGluRs, в общее повышение [Ca²⁺]i не превышает 20%.